CCK8檢測細胞增殖/毒性的原理、方法及注意事項
                                                    發布時間:2015-6-4
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                                                     一、CCK8檢測細胞增殖/毒性的原理

                                                     
                                                     
                                                    Cell Counting Kit-8(簡稱CCK-8)試劑可用于簡便而準確的細胞增殖和毒性分析。其基本原理為:該試劑中含有WST-8【化學名:2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】,它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產物(Formazan dye)。生成的甲瓚物的數量與活細胞的數量成正比。因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析。


                                                    用途:藥物篩選、細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗

                                                    CCK8的優點
                                                    • 使用方便,省去了洗滌細胞,不需要放射性同位素和有機溶劑;
                                                    • CCK-8法能快速檢測;
                                                    • CCK-8法的檢測靈敏度很高,甚至可以測定較低細胞密度;
                                                    • CCK-8法的重復性優于MTT 法;
                                                    • CCK-8法對細胞毒性小;
                                                    • CCK-8細胞活性檢測試劑中為1瓶溶液,毋需預制,即開即用。

                                                    CCK8的缺點
                                                    • 與MTT法相 比,CCK8和XTT的價格比較貴。
                                                    • CCK8試劑的顏色為淡紅色,與含酚紅的培養基顏色接近,不注意的話容易產生漏加或多加。


                                                    與以往的增殖/毒性測定試劑相比較

                                                    檢測方法
                                                    MTT法
                                                    XTT法
                                                    WST-1法
                                                    CCK8法
                                                    甲臢產物的水溶性
                                                    差(需加有機溶劑溶解)
                                                    產品性狀
                                                    粉末
                                                    2瓶溶液
                                                    溶液
                                                    1瓶溶液
                                                    使用方法
                                                    配成溶液后使用
                                                    現配現用
                                                    即開即用
                                                    即開即用
                                                    檢測靈敏度
                                                    很高
                                                    很高
                                                    檢測時間
                                                    較長
                                                    較短
                                                    較短
                                                    最短
                                                    檢測波長
                                                    560-600nm
                                                    420-480nm
                                                    420-480nm
                                                    430-490nm
                                                    細胞毒性
                                                    高,細胞形態完全消失
                                                    很低,細胞形態不變
                                                    很低,細胞形態不變
                                                    很低,細胞形態不變
                                                    試劑穩定性
                                                    一般
                                                    較差
                                                    一般
                                                    很好
                                                    批量樣品檢測
                                                    可以
                                                    非常適合
                                                    非常適合
                                                    非常適合
                                                    便捷程度
                                                    一般
                                                    便捷
                                                    便捷
                                                    非常便捷


                                                    二、CCK8檢測細胞增殖/毒性的方法

                                                    實驗一:細胞增殖分析

                                                    1、制備細胞懸液:細胞計數
                                                    2、接種到96孔板中:根據合適的鋪板細胞數,每孔約100ul細胞懸液,同樣的樣本可做3個重復。
                                                    3、37℃培養箱中培養:細胞接種后貼壁大約需要培養2-4小時,如果不需要貼壁,這步可以省去。
                                                    4、加入10ul CCK8:由于每孔加入CCK8量比較少,有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差,建議在加完試劑后輕輕敲擊培養板以幫助混勻。或者直接配置含10%CCK8的培養基,以換液的形式加入。
                                                    5、培養1-4小時:細胞種類不同,形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話,可以繼續培養,以確認最佳條件。特別是血液細胞形成的Formazan很少,需要較長的顯色時間(5-6小時)。

                                                    6、測定450nm吸光度:建議采用雙波長進行測定,檢測波長450-490nm,參比波長600-650nm。

                                                    實驗二:細胞毒性分析
                                                    1、制備細胞懸液:細胞計數
                                                    2、接種到96孔板中:根據合適的鋪板細胞數,每孔約100ul細胞懸液,同樣的樣本可做3個重復。
                                                    3、37℃培養箱中培養:細胞接種后貼壁大約需要培養2-4小時,如果不需要貼壁,這步可以省去。
                                                    4、加入不同濃度的毒性物質
                                                    5、37℃培養箱中培養:加入毒性物質的培養時間,要看毒性物質的性質和細胞的敏感性,一般要根據細胞周期來決定,起碼要一代以上的時間。
                                                    6、加入10ul CCK8:由于每孔加入CCK8量比較少,有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差,建議在加完試劑后輕輕敲擊培養板以幫助混勻。
                                                    7、培養1-4小時:細胞種類不同,形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話,可以繼續培養,以確認最佳條件。特別是血液細胞形成的Formazan很少,需要較長的顯色時間(5-6小時)。
                                                    8、測定450nm吸光度:建議采用雙波長進行測定,檢測波長450-490nm,參比波長600-650nm。


                                                    注:

                                                    • 若暫時不測定OD值,可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液,并遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。24小時內測定,吸光度不會發生變化。
                                                    • 如果待測物質有氧化性或還原性的話,可在加CCK8之前更換新鮮培養基(除去培養基,并用培養基洗滌細胞兩次,然后加入新的培養基),去掉藥物影響。當然藥物影響比較小的情況下,可以不更換培養基,直接扣除培養基中加入藥物后的空白吸收即可。



                                                    三、CCK8檢測細胞增殖/毒性的注意事項


                                                    • 當使用標準96孔板時,貼壁細胞的最小接種量至少為1,000 個/孔 (100 μl 培養基)。檢測白細胞時的靈敏度相對較低,因此推薦接種量不低于2,500 個/孔 (100 μl 培養基)。
                                                    • 酚紅和血清對CCK8法的檢測不會造成干擾,可以通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去。
                                                    • CCK8可以檢測大腸桿菌,但不能檢測酵母細胞。在細胞增殖實驗每次測定的過程中需要避免細菌污染,以免影響結果。
                                                    • CCK-8在0-5℃下能夠保存至少6個月,在-20℃下避光可以保存1年。
                                                    • 當在培養箱內培養時,培養板最外一圈的孔最容易干燥揮發,由于體積不準確而增加誤差。一般情況下,最外一圈的孔只加培養基,不作為測定孔用。
                                                    • 在培養基中加入CCK8,培養一定的時間,測定450 nm的吸光度即為空白對照。在做加藥實驗時,還應考慮藥物的吸收,可在加入藥物的培養基中加入CCK8,培養一定的時間,測定450 nm的吸光度作為空白對照。
                                                    • 金屬對CCK-8顯色有影響:當終濃度為1 mM的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會抑制5%、15%、90%的顯色反應,使靈敏度降級。如果終濃度是10 mM的話,將會100%抑制。
                                                    • 懸浮細胞由于染色比較困難,一般需要增加細胞數量和延長培養時間。
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